糖尿病与胰岛素的故事(七)

18.临床上使用的胰岛素

在临床上使用的胰岛素根据来源和化学结构的不同,可以分为三大类或三代产品:第一代是动物源性胰岛素,主要从猪和牛等动物胰脏提取而来,在1923年礼来生产的世界上第一支商品化产品因苏林就是动物胰岛素。动物源性胰岛素存在异源性过敏反应问题,目前已经逐渐淘汰,国际市场的占有率只有2%不到。我国应用却还很普遍,动物源性胰岛素还入选了我国2009年版的国家基本药物目录。长期使用动物胰岛素会产生免疫反应,胰岛素耐药,反复出现的高血糖、低血糖,注射部位脂肪萎缩,水肿(水钠潴留)等问题。

第二代是基因重组人胰岛素,主要利用大肠杆菌或酵母表达人胰岛素。商业化的基因重组人胰岛素首先由礼来公司于1982年推出,基因重组人胰岛素在国际和国内市场的集中度都很高,占据了全球90%以上的市场份额。国内市场主要被国际上大的胰岛素生产公司占据。2006年,我国胰岛素销售额为23亿元,国际上大的胰岛素生产公司产品占据市场95.6%。与动物源胰岛素不同,基因重组人胰岛素国内企业较少,而国内企业加起来总共不到5%的市场份额。基因重组人胰岛素起效慢,存在高血糖和低血糖问题。

第三代是人胰岛素类似物,通过对人的胰岛素基因进行改造获得。胰岛素类似物起效更快,作用更持久,副作用更小。胰岛素类似物控制血糖的效果与人胰岛素类似,在模拟生理性胰岛素的分泌以及减少低血糖的方式方面更具优势。目前,此类胰岛素在国内应用少,市场还很小,国内只有一家公司具有胰岛素类似物的研制能力。

在临床上使用的胰岛素可根据作用特点分为超短效胰岛素类似物、短效胰岛素、中效胰岛素、长效胰岛素、长效胰岛素类似物、预混胰岛素和预混胰岛素类似物等。

目前在我国市场上的胰岛素制剂从技术水平上可以分为低端的动物胰岛素(即一代胰岛素)、中端也是用量最大的基因重组人胰岛素(即二代胰岛素)、高端的胰岛素类似物(又称三代胰岛素)等三大类。其中动物胰岛素曾经因为价格低廉占据过一定的市场份额,但现在市场份额几乎可以忽略不计了,而高端的胰岛素类似物因其本身的优异特性,更接近人体生理,更少引起低血糖等因素而发展迅猛。从图40 可以看到临床使用的胰岛素的发展情况。

图44.临床应用胰岛素的发展(引自网络文献)

19.用细菌生产人胰岛素

将猪胰岛素改造成为人胰岛素,并在临床上应用成功。发现用人胰岛素治疗糖尿病时,一般不会产生抗原反应,因此疗效高;因为人胰岛素就是人体蛋白,极少产生药物过敏反应,或皮下脂肪萎缩。与动物胰岛素相比免疫性胰岛素抵抗发生率显著下降,用药剂量也显著减少;而且人胰岛素吸收快、作用快、药效集中。但是以猪胰岛素为原料再加工成人胰岛素,生产成本大幅度提高,会造成大量临床应用困难。而且将猪胰岛素改造成人胰岛素需要养更多的猪,资源有限。用猪胰岛素改造为人胰岛素的成本更高,患者的治疗费用就会翻倍。这些成为将猪胰岛素改造成人胰岛素的瓶颈。

随着生命科学的不断进步和生物技术,特别是基因重组、基因工程的发展,使得开发新的人胰岛素生产方法成为可能。

最初,人们了解这些以后设想将胰岛素基因如果转到细菌,比如大肠杆菌中来生产人胰岛素。但是由于大肠杆菌不具备胰岛β细胞的加工、转运能力;而且大肠杆菌对基因的偏好性与人的细胞对基因的偏好性不同,将人的胰岛素基因转移到大肠杆菌中,基因转录和翻译效率就会大大降低。另外,由于人们掌握了人胰岛素的氨基酸组成和基因转译成蛋白质的“三联密码子”原则后,科学家们就考虑可以根据人胰岛素的氨基酸排列顺序,和大肠杆菌对基因的脱氧核糖核酸偏好性,分别人工合成胰岛素A和B链的基因,转入大肠杆菌,分别表达,然后分离纯化后在经过化学加工,合成人胰岛素。

根据这样的设想,进行了大量的研究,建立了胰岛素的AB链合成法。将人工合成的人胰岛素A链和B链基因分别与半乳糖苷酶基因连接,形成融和基因,再分别转入大肠杆菌中构建能够分别表达A链和B链基因与半乳糖苷酶基因工程菌。

图45.分别构建人胰岛素的A、B链基因工程菌生产人胰岛素示意图(引自网络文献)

分别构建的A和B链基因的两种基因工程菌,经分别培养,获得大量工程菌菌体细胞,然后将细胞破碎,释放出表达的A链及B链与半乳糖苷酶结合的融合体。但是因为大肠杆菌属于原核菌,蛋白质合成功能有限,基因表达的蛋白质大多数是没有活性的,不溶于水的包含体。需要使用尿素溶液使之溶解,然后用透析的方法将尿素逐渐除去,使蛋白质分子链重新排布,使之具有正确结构和活性,这称为“变性和复性“。经过分离纯化,获得纯净的与半乳糖苷酶结合在一起的A链及B链融合蛋白。再经过化学处理除掉半乳糖苷酶,获得A链及B链,利用化学氧化作用,通过二硫键将A链和B链连接起来,合成完整的有活性的人胰岛素。

这样的生产工艺过程和条件过于复杂,由于A链和B上共存在六个半胱氨酸残基,体外二硫键的正确配对率较低,通常只有10%-20%,因此采用这条工艺路线生产的重组人胰岛素每克成本高达100美元以上。为了进一步降低生产成本,随后又开发了新的利用基因工程菌生产重组人胰岛素的工艺路线。

为了采用完整的人胰岛素基因构建基因工程菌,首先需要获得完整的人胰岛素基因。将胰岛β细胞分离、破碎,从中提取总核糖核酸(RNA)。由于带有基因密码信息的信使RNA(mRNA)带有人胰岛素的全部信息。需要从总RNA中将我们需要的人胰岛素mRNA分离出来。好在在mRNA的一端有一段特别的结构,能够特异吸附在寡脱氧胸腺苷酸通过5′-磷酸与纤维素共价结合的一种层析介质上。使用它可以将一端带有一段特别的结构mRNA与其他mRNA分离出来。但是还不是纯净的人胰岛素mRNA,其中还可能存在其他蛋白质的mRNA,还需要进一步的分离。

由于人胰岛素基因的DNA序列已经知道,可以设计一个“引物”,实际上就是按着人胰岛素基因两端的脱氧核糖核酸的排列顺序人工合成的大约有十几个脱氧核糖核酸的两个DNA片段。它们可以分别与mRNA相应配对的一端结合,然后在逆转录酶的催化作用下,按着mRNA的核糖核酸的排列顺序合成出与之匹配的DNA,称为cDNA。然后就可以利用DNA聚合酶催化,以cDNA为模板大量合成人胰岛素基因。这样获得的基因是完整的人前胰岛素原的基因。然后将其转到大肠杆菌构建基因工程菌,经大规模培养生产人胰岛素。

图46.表达人前胰岛素原基因的大肠杆菌基因工程菌的构建(引自网络文献)

图47.利用大肠杆菌基因工程菌生产人胰岛素的工艺流程示意图(引自网络文献)

利用这种方法生产人胰岛素要比以前的A、B链分别生产然后再拼接的方法来的简便,成本较低,规模可以更大。但是,由于大肠杆菌表达的人胰岛素依然以包含体形式存在,需要复杂的变性复性处理,而且收率不高,后面的处理纯化也十分复杂,促使人们寻找更好的方法。

之后人们又将A链和B链基因融合在一起,再与β半乳糖苷酶基因融合转入大肠杆菌,构建一种新的A链和B链同时表达方法。但因为表达后依然需要将包含体变性复性,去除β半乳糖苷酶,然后将连在一起的A链和B链裂解开,再进行组合折叠,获得有活性的人胰岛素。这一新的方法后处理也十分复杂。

后来发现将胰岛素基因原基因与β内酰胺酶基因融合注入大肠杆菌,可以使表达的融合蛋白分泌到细胞外,而不是包含体,因此使得后面的分离纯化和加工简单化,使得人胰岛素的生产又前进了一大步。

随着基因重组技术和表达宿主的扩宽,不断探索其他可以利用的宿主菌,发现酵母菌,作为真核生物,在基因表达和蛋白质转译、加工、运输等多个方面都优于大肠杆菌。可以将翻译的蛋白质分泌到细胞外,具有正确的天然结构,使得产物的分离纯化工艺大大简化,进步可以降低生产成本。

因此科学家将通过胰岛β细胞获得的前胰岛素原基因克隆到酵母菌细胞中,发现利用酵母菌表达,在许多方面优于大肠杆菌。使得人胰岛素的生产过程大大简化。

首先酵母菌表达的是能够分泌到细胞外的可溶性胰岛素原,而不是没有活性的不可溶的包含体。因此工程菌大规模培养后,胰岛素原溶解在培养液中,只需离心除去菌体,不需要破碎细胞,更不需要变性复性。经过比较简单的超滤浓缩,除去部分小分子杂质,然后进行离子交换色谱,直接将胰岛素原分离纯化。然后加入沉淀剤使之沉淀,离心获得纯化的胰岛素原。利用胰蛋白酶和羧肽酶处理,脱去C肽,经过进一步的纯化、结晶,即可获得合格的人胰岛素产品。

利用构建的酵母基因工程菌生产人胰岛素显然比利用大肠杆菌基因工程菌生产人胰岛素具有更大优势。

图48.利用工程菌酵母生产人胰岛素的工艺流程示意图(引自网络文献)

自1982年,美国礼来公司(Ely LiLi)首先使用重组大肠杆菌生产人胰岛素,成为世界上第一个上市的基因工程药物。1987年,诺和诺德(Novo nordisk)公司又推出了利用重组酵母菌生产人胰岛素的新工艺。这两个企业每年生产十几吨的人胰岛素,几乎可以满足世界糖尿病患者对胰岛素的市场需求。

20.人胰岛素的“进化”

人体分泌的胰岛素是“快进快出”,进餐后血糖开始升高,胰腺受到刺激立刻大量分泌胰岛素进入血液,很快达到峰值。然后分泌又迅速减少,恢复到基础胰岛素水平。餐后因消化产生的大量葡萄糖进入肝脏,在胰岛素的控制下迅速转化为糖原,储存起来,使得血液中的葡萄糖浓度很快降到正常水平。

图49. 在人体内胰岛素和血糖的变化(引自网络文献)

而皮下注射人胰岛素不能直接进入血液,因为胰岛素会聚合,形成六聚体、四聚体、二聚体和单体,不管是餐前还是餐后注射,经过充分稀释,聚合体经过解聚,形成二聚体或单体胰岛素,才能通过毛细血管壁进入血液,这样就造成吸收延滞期。这个延迟使得人胰岛素达到峰值和恢复到基础水平的时间都有延长。因此人胰岛素必须在餐前提前30分钟注射,才能与进餐后的血糖高峰时间同步。

图50.人胰岛素聚合体体结构示意图(引自网络文献)

A单体   B二聚体   C六聚体

为了解决上述问题,科学家首先利用X-射线衍射研究了人胰岛素的分子空间构型和形成聚合体的原因。在适当pH条件下,不同胰岛素分子的肽链之间可以形成氢键,特别是在锌离子存在下,胰岛素分子之间发生集聚,可以形成由二到六个胰岛素分子构成的不同聚合体。作为药物使用的人胰岛素制剂主要以六聚体形式存在,进入人体后胰岛素聚合体要逐渐解离,在人体内真正发挥作用的是单分子的胰岛素。

20世纪90年代末,科学家们根据人胰岛素的氨基酸排列顺序和形成聚合体的原因,对人胰岛素进行“小手术”。主要是根据组成人胰岛素的51个氨基酸中关键的氨基酸对空间构型、聚合作用及药效的影响,找到可以改造或可替换的氨基酸。对人胰岛素的“小手术”,就是根据每个氨基酸都是由基因上对应的三个脱氧核糖核酸的“三联密码子”决定的原则,通过将有利于人胰岛素分子间形成氢键的氨基酸进行更换,从而改变人胰岛素分子之间的相互作用,减少形成聚合体的能力,而研发出具有超短效、短效和长效人胰岛素类似物。

这种对人胰岛素基因中关键的脱氧核糖核酸进行改变,也就是对基因实行改造,在生物技术里称为“蛋白质工程”。利用这种方法构建基因工程菌合成的重组人胰岛素与胰岛素受体结合性能、淋巴细胞和成纤维细胞的应答能力、降血糖作用、血浆药代动力学等指标上均与天然胰岛素没有任何区别,而且还具有无免疫原性、注射吸收迅速等优点,充分展示了基因工程在生物医药领域中的巨大潜力。

人胰岛素类似物改变了人胰岛素的缺陷,更好地模仿人体内胰岛素的特点,更加符合人体的生理需求。科学家又将速效和中效胰岛素按一定比例预混,制作出预混胰岛素类似物。这类胰岛素的特点是兼顾了短效和长效人胰岛素类似物的优点,可以兼顾空腹血糖和餐后血糖,而且更安全,减少低血糖的发生,也不需要餐前30分钟注射,临餐注射即可,更为便利。

超短效胰岛素,起效时间为15分钟,作用高峰30~45分钟,持续时间约2~4小时,主要有天门冬氨酸胰岛素和赖脯胰岛素。这两个都是人胰岛素类似物,是通过将人胰岛素的肽链上的氨基酸进行移位、替代、重组等进行新的排列,来改变胰岛素作用时间。赖辅胰岛素是在人胰岛素B28位脯氨酸由带负电荷的赖氨酸取代而形成;而门冬胰岛素则是由人胰岛素B28位脯氨酸由天门冬氨酸代替形成。之所以它们能在短时间内迅速发挥降糖作用就是因为这些结构的改变使电荷排斥,阻隔了胰岛素单体间的自我聚合。在溶液中胰岛素主要以单体和双体的混合物形式存在,而单体就是胰岛素作用的结构,所以其作用时间就快了。

图51. 人胰岛素与人胰岛素类似物的氨基酸的变化 (引自网络文献)

中效胰岛素主要是低精蛋白锌胰岛素,主要包括低精蛋白锌胰岛素和胰岛素锌混悬液,起效时间为1.5~4小时,作用高峰4~12小时,持续时间约14~20小时。市场上常用的有低精蛋白重组人胰岛素注射液(甘舒霖N);中性低精蛋白锌人胰岛素(诺和灵N);精蛋白锌重组人胰岛素注射液(优泌林N)等。中效胰岛素的结构是通过鱼精蛋白将几个六聚体聚集在一起,从而解离为单体的时间需要更长,这样就能延长胰岛素的作用时间。这类胰岛素需每天定时分一次或二次注射。

长效胰岛素主要有甘精胰岛素和地特胰岛素,这两例胰岛素都属于人胰岛素类似物。其中甘精胰岛素是将人胰岛素B31-B32-增加了2个精氨酸,A21位由甘氨酸替代天门冬氨酸,通过改变氨基酸的排列使胰岛素的等电点发生改变,从原来的pH5.14变为6.17,人体pH值是7.14,这样当它注入到人体内,由于等电点不同,进入人体后就会发生沉淀,同时,因为制剂中存在锌离子,能增加胰岛素六聚体的稳定性,六聚体分解的时间也延长,造成吸收延迟且延长,释放缓慢平稳,几乎没有峰值。

图52.胰岛素类似物 —–甘精胰岛素 (引自网络文献)

地特胰岛素也是通过氨基酸的改变成为中性可溶性液体,以六聚体形式存在,皮下注射后其吸收扩散速度缓慢,在血浆中98%~99%与白蛋白结合,以极其缓慢速度释放入血,药物的半衰期显著延长,约为14小时,血浆浓度平稳,峰谷曲线小。此类胰岛素一般每日定时注射一次,作为补充基础胰岛素。

预混胰岛素,是将短效胰岛素和中效胰岛素按不同比例进行混合,使得同时具备短效和长效作用的胰岛素。常看到带数字的的胰岛素(如30R、50R等),其中的数字代表的就是短效或超短效胰岛素成分所占的比例。即使是预混型的胰岛素,也要知道,人胰岛素是需要餐前15-30分钟注射;而人胰岛素类似物则不然,注射后无需等待,可以马上进食。但是,由于在人体内代谢速度比较快,半寿期较短,故单独使用时有可能作用高峰期出现低血糖或清晨高血糖。

由于不同胰岛素和他们的混合制剂具有不同的特性,大夫会根据病人的病情进行调整,选择适合的胰岛素制剂进行治疗。

图53.胰岛素分泌与注射甘精胰岛素在体内的存在曲线(引自网络)