糖尿病与胰岛素的故事(六)

16.胰岛素的人工合成

1955年英国F.桑格小组测定了牛胰岛素的全部氨基酸序列,开辟了人类认识蛋白质分子化学结构的道路。1965年9月17日,中国科学家人工合成了具有全部生物活力的结晶牛胰岛素,它是第一个在实验室中用人工方法合成的蛋白质。稍后美国和联邦德国的科学家也完成了类似的工作。70年代初期,英国和中国的科学家又成功地用X射线衍射方法测定了猪胰岛素的立体结构。这些工作为深入研究胰岛素分子结构与功能关系奠定了基础。人们用化学全合成和半合成方法制备类似物,研究其结构改变对生物功能的影响,进行不同种属胰岛素的比较研究,研究异常胰岛素分子病,即由于胰岛素基因的突变使胰岛素分子中个别氨基酸改变而产生的一种分子病。这些研究对于阐明某些糖尿病的病因具有重要的实际意义。

图37.1965年我国首次人工合成了牛胰岛素结晶(http://images.shobserver.com/news/news/)

图38.牛胰岛素分子的三维晶体结构(引自网络文献)

图39. 对人工合成的牛胰岛素进行生物活性测定(http://images.shobserver.com/news/news/)

图40.原中国科学院院长郭沫若接见参加人工合成牛胰岛素的工作人员(http://images.shobserver.com/news/news/)

1958年我国提出“赶超世界先进水平”的口号,进入“大跃进”时代,科学界提出了合成牛胰岛素的设想。1958年12月21日,中国科学院上海生物化学研究所确定了人工合成胰岛素的课题,其基础是发现了胰岛素还原型A、B链可以重组成天然胰岛素分子。

1960年5月5日,有中国科学院上海分院的生物化学院研究所(生化所)、有机化学研究所(有机所)、药物研究所(药物所)、细胞生物学研究所、生理研究所等五个研究所组成共140人的“大兵团作战”团队。有机所采取合成不同小肽,然后拼接合成大肽段的方法完成了A链1-5五肽以及6-21十六肽的工作。

图41.汪猷与A链合成科研人员在有机所门口合影(http://images.shobserver.com/news/news/)

1960年底,科学院的胰岛素“大兵团作战”结束,此后的胰岛素合成工作变为各个单位自行研究的状态。1963年10月,北京大学化学系参加合作,并改变了A链的合成方法,由原来的5加16变为9加12,即先分别制取N-端九肽和C-端十二肽,再经过叠氮法缩合成带保护基的A链。由北大合成A链的前9肽,有机所合成A链的后12肽,生化所仍合成B链,并负责连接A链和B链。1964年初,A链合成工作进行了重新部署,北大和有机所的工作人员统一做了安排,分成三个工作小组,分别负责前九肽和后十二肽的合成以及分析鉴定工作。1965年5月,胰岛素A链的合成实现,并进行了与天然胰岛素B链的组合。当A链和生化所合成的B链积累到一定量时,在生化所对人工合成的胰岛素A链和B链做全合成试验,并最终于1965年9月17日得到了牛胰岛素结晶。

在胰岛素人工合成的研究中,为了检定每步合成产物的纯度,从原料到每一个中间体片段,从小片段到大片段,都要通过元素分析、层析、电泳、旋光测定、酶解及氨基酸组成分析,其中任何一项分析指标达不到,都要进一步提纯后再进行分析,力求全部通过。因为在胰岛素全合成近200步的反应中,任何一步的产物不纯,都会影响到以后的合成。也只有如此,才能保证科学研究的可重复性和可证实性。正是因为如此,才能高质量地实现了全合成。胰岛素的合成进行了多次重复实验,其中A链21肽合成过30批,半合成进行了60次,人工全合成A链和B链共重复了27次,分16批进行,其中两批进行了结晶。中间肽段通过几种方式合成,关键数据经过多次重复,增加了可靠性。

除了在合成工作的前期阶段,希望得到一整套很完整的分析数据来证实中间产物的纯度以保证合成过程的可靠性之外,当1965年9月17日得到结晶时,即便清楚地知道这项工作在国际上取得优先权的重要性,在1965年11月国家科委为人工合成结晶牛胰岛素举行的鉴定会上,以汪猷为首的一些有机化学家认为证据还不够充分,并给出结论:“可以认为已经通过人工全合成获得了结晶牛胰岛素”,并希望“对于全合成最后结晶产物,应进一步分析鉴定,以期获得更为充分的证明”。此后,生化所、有机所和北大三个单位的研究人员又对胰岛素结晶进行了电泳、层析、免疫双扩散、抗血清中和试验以及酶解、兔血糖测定等测试,发现所合成的结晶产物,其带电荷的性质、层析行为、免疫化学性能、一级结构中的三个硫硫键的结合方式,以及降低血糖的生理作用,均与天然胰岛素无异,这些数据充分证明了,合成的结晶产物就是结晶牛胰岛素。在1966年4月15-21日于北京举行扩大的人工合成牛胰岛素鉴定委员会第二次会议上,给出“上述结果充分证明了人工全合成的结晶产物就是牛胰岛素”的结论。

1973年底,杨振宁致函中科院郭沫若院长,称自己准备提名生化所、有机所和北京大学代表各一人合得1974年诺贝尔化学奖,然而中科院和外交部拒绝了这一好意。理由有,一是胰岛素合成是科研人员在党的领导下集体努力的结果,难以提出代表人选;二是该奖金系由资本主义国家颁发,还是不拿为好。1978年,杨振宁再次向邓小平表示,自己愿意为胰岛素合成提名诺贝尔奖。同年,美籍华裔逻辑学家王浩也作出相同提议;而瑞典皇家科学院诺贝尔化学奖委员会写信给生化所所长王应睐,也要他推荐诺奖候选人名单。

当时改革开放刚刚起步,中国人已经开始重视诺贝尔奖。中科院当年年底专门召开了一次“胰岛素人工全合成总结评选会议”,以无记名投票方式选出钮经义、邹承鲁、季爱雪、汪猷四名代表后,考虑到每个单项奖的获奖人数不能多于3人,又考虑到联邦德国、美国在胰岛素人工合成方面也取得较好成绩,有可能此奖将由两国或三国科学家共同获得,最终决定由钮经义代表全体研究人员申请诺贝尔奖。

然而,胰岛素合成工作最终还是没能获奖,最后,1979年度诺贝尔化学奖颁发给了具有开创性的将硼化物和磷化物用于有机合成的美国人查尔斯·布朗(Herbert Charles Brown)和德国人格奥尔格·维蒂希(Georg Wittig)。

中国没有因人工合成胰岛素获得诺贝尔奖,也没有其他国家因为合成胰岛素而获奖。虽然胰岛素合成方法复杂,但是每个国家都是应用已有的多肽合成方法,没有创新。而获得诺贝尔奖的成果必须是完全创新的成果。1958年,英国化学家桑格获奖的原因是他的发现完全是新的,前无古人。但是无论如何,在上世纪六十年代的中国,以当时的国力和技术水平,能够在全世界率先人工合成纯度较高的胰岛素结晶,怎么说也是一项伟大的成就。不管是否拿了诺贝尔奖,老一代科学家的精神,永远值得我们继承和发扬。

为了表彰我国科学家在胰岛素全合成研究中做出的贡献,1982年,人工合成胰岛素研究成果获得国家自然科学一等奖。

17.胰岛素的检测

胰岛素的缺失是糖尿病发病的直接原因,要了解糖尿病的病情,确定糖尿病类型,必须了解胰岛素在病人体内的变化和规律;胰岛素作为治疗糖尿病的天天使用的一线药物,要了解治疗效果和各种副作用,不论是研究者,还是大夫、患者都需要及时准确的了解在治疗过程中胰岛素的变化和效果,因此测定体内胰岛素的含量,就非常重要。

为了研究开发有效的治疗糖尿病的胰岛素药物,正确评价不同剂型的胰岛素在人体内的确切疗效和安全性,必须研究胰岛素在动物和人体内的药物的吸收、分布、代谢和排泄的规律,要研究胰岛素在生理学、药效学和毒理学,进行合理的临床试验,必须获得准确的胰岛素变化数据,因此,对胰岛素的准确定量检测是开展这些研究工作的基础。

对于药物本身而言,在生产过程中,产品质量控制和质量标准建立上都离不开准确定量检测胰岛素,它不仅是各项工作的基础,而且是评价药物处方的关键。因此,人们对胰岛素的检测予以了高度关注。

随着科学技术的不断进步,胰岛素的检测方法不断发展。好的胰岛素检测方法需要满足特异性高,灵敏度高、重现性好、回收率高、线性范围宽等要求。要达到可专一地识别胰岛素又不受其它组分的干扰,这是建立检测方法的主要难题。另外胰岛素的给药量一般极低,更要求高灵敏度测定方法。许多常规的药物分析方法在用于胰岛素分析时在特异性、灵敏度和精确度方面都有所欠缺,难以套用。为了解决这些难题,满足胰岛素检测的要求,也发展了一些有效的检测方法。

比如生物检测法,简单地讲,是给小白鼠或兔子注射稀释不同倍数的标准胰岛素,定期测定血糖,绘制成胰岛素注射量与血糖关系的标准曲线。测定具体样品时,给实验鼠注射样品后检测它的血糖,就可以从标准曲线上查找出样品中胰岛素的含量。这样获得的结果虽然能够反映其生物活性,但实验条件严格,操作程序复杂,耗时较多;由于测定使用的小鼠个体存在差异,影响因素较多,获得的结果的误差较大,重复性较差。

色谱法,不论是高效液相色谱法(HPLC),还是高效毛细管电泳法(HPCE),虽然它具有简便快捷、选择性高、分离效率高及检测灵敏度高等优点,但是高效色谱法对于复杂体系中的微量胰岛素的测定,需要对待测样品则进行必要的预处理,不然胰岛素的信号难以检测到。而高效毛细管电泳法进样量小,不易控制,这给实验的重复性带来影响,而且对浓度很低的样品无法提供足够的灵敏度。

免疫学方法是利用抗原和抗体高度特异性结合的原理,可用于检测分析各样品中的目标物质。我们都知道,多数异体蛋白质在生物体内都会发生免疫反应,产生一种能够特异与之结合的物质,被称为“抗体”,而这种异体蛋白质被称为“抗原”,而且一种抗原多半只能引发一种抗体,而一种抗体也多半只能与一种抗原结合。实验证明,如果给抗原带上放射性同位素,使之成为带有放射性标记的抗原,也可以和原来的抗体识别、结合。

放射免疫测定法就是将过量的放射性标记抗原与抗体放在一起,在一定的环境条件下,抗体便与抗原始合,然后加入含有待测抗原的样品,就会和已经与放射性标记抗体结合的放射性标记抗原竞争,加入的量越多,结合在抗体上的放射性标记抗原被取代的越多,也就是抗体上结合的放射性标记的抗原愈少。这样,若是能够把结合在一起抗原和抗体与没有结合的抗原分开,然后用测定放射性的方法,测这些抗体的放射性,就可以推算出样品中有多少无放射性标记抗原了。

而将结合的抗原和抗体与没有结合的抗原分开,可以采取待反应平衡后加入免疫吸附剂,吸附反应液中剩余的游离标记抗体,经离心分离,去掉多余的标记抗体。或者预先制备固相抗体,然后将待测样品加入过量固相抗体中,反应一定时间后,再加标记抗体,生成固相抗体-抗原-标记抗体夹心复合物,经洗涤除去多余标记抗体。前一种方法称为免疫吸附法,后一种方法称为双位点夹心法。

放射免疫法将抗原与抗体的特异反应和灵敏的放射性检测相结合,是一种灵敏度高、较简便的测量法,几乎可测定生物体内任何物质,包括生物体本身分泌的各种激素,病人口服或注射的各种药物,一些病毒抗原等,已广泛用于临床常规检验。

放射免疫法一般使用的时放射性同位素碘标记抗体,虽然计量很低,但必定放射性对人体有一定的伤害。随着科学技术的发展,人们将免疫原理与其他的灵敏的检测方法相结合,如利用酶催化的高度专一性可产生特定的反应产物的特定,发展了酶标免疫法,发光免疫法,以及免疫印迹法和胶体金免疫法等。

免疫学方法的缺点在于首先要制备出用于检测的纯的抗原和抗体。它测定的是蛋白或多肽的免疫活性而不是生物活性,不能同时测定代谢物。而且具有抗原决定簇的代谢片段可能会增加测定误差,不同来源的抗体与相同的蛋白或多肽反应可能有较大的差别,还可能受到内源物质的干扰。

但免疫法毕竟是一种迅速、灵敏、适于批处理的方法,已开发数十种能满足各种应用的商品试剂盒,获得广泛应用。现在标记的抗体已由多克隆抗体发展到单克隆抗体,特异性高,与其他检测方法相比,更简明,易于控制。

放射免疫测定技术是在上个世纪50年代末由美国学者罗莎琳.苏斯曼.雅洛(RosalynSussmanYalow)和索乐曼A.贝尔森(Solomon A.Berson)为了检测胰岛素而发明的。

罗莎琳1921年7月19日出生于美国纽约,父母都是犹太人,她从小酷爱自然科学,又是一个倔强不屈的孩子。3岁时,有一次跟母亲回家,罗莎琳坚持要走自己选择的另一条路,母亲以为那条路根本回不了家,所以没有答应她。罗莎琳赖在地上不走。“好吧。”母亲最终没能“犟”过她。让她自己走了,不一会儿,罗莎琳高兴地喊:“妈妈,到家了!”母亲抬头一看,千真万确,已经到了自家的房后。在此居住了许多年的母亲居然不知还有这么一条可以回家的近道,望着一脸灿烂的罗莎琳,母亲惊讶得一时语塞。

10岁那年,罗莎琳到女子中学读书,因学校离家较远,她每天都要坐车。刚开始时,母亲怕她下错了车站,于是就偷偷地跟着她上了车,不曾想被罗莎琳发现了,倔强的她大为光火:“我不是个小孩子!”发了一通脾气后,把尴尬的母亲“扔”在车上,径自改乘另一趟车去上学了。

15岁高中毕业后,父母建议罗莎琳去当小学老师,“不!”她坚持一定要上大学。父母拗不过她,于是她成了亨特学院里的一名学生。

到亨特学院后,罗莎琳很快迷上了物理。这说起来也是一种偶然。物理学课程被安排在午饭后,而这段时间的学习效果是最差的。物理课老师也明白这一点,为了提高学生们的学习兴趣,老师想出了一个“绝招”:他在授课的内容里故意加进两处错误,然后让同学们去找。这样,无精打采的同学们一下子来了精神。罗莎琳最先找到了错误,而且不是两处,是三处,竟“逼”得老师也不得不叫起真儿来。正是这一偶然小事,使罗莎琳学习物理的兴趣大增。

不久,伊伦•约里奥.居里写的关于她母亲的传记《居里夫人》出版了,17岁的罗莎琳怀着十分崇敬的心情一口气读完了这本书,从此,她的理想更高了:当科学家,做“居里夫人第二”。

走自己选择的路,说起来容易,做起来难啊。20世纪40年代初期,反犹浪潮波及到了美国,同时,对妇女的歧视更是远没有消除。出生于中下层犹太人家庭的罗莎琳非常明白,作为犹太女性的她,要想获得研究院的资助继续求学是何等的困难。但是,天生不服输的她偏偏就有个“明知不可为而为”的倔脾气,为了能够继续求学,在大四下半学期,罗莎琳设法当上了哥伦比亚大学生物化学家鲁道夫.斯科霍曼博士的秘书。凭借这个职务,她便可以在哥伦比亚大学旁听研究生的课程。

1941年1月,20岁的罗莎琳从亨特学院取得物理学与化学学士学位。大学毕业后,父母力劝罗莎琳当一名中学老师。罗莎琳又是一个坚决不答应,她已经有了明确的目标,她一定要坚持自己的选择。深知女儿倔强的父母虽然不理解她,但同以往一样,还是依从了她,“好吧,那就走你自己选择的路吧。”

罗莎琳大学毕业后被伊利诺斯大学的罗伯特.佩托恩教授破例录用,做了一名助教.伊利诺依大学给了她一份奖学金,老教授很赏识她的勇气和坚毅,让她管理一个光学实验室,并同时攻读研博士学位。罗莎琳是自1917年以来该院的第一位女研究生。罗莎琳在上班的第一天认识了也在攻读物理学的研究生艾伦.雅洛(Aaron Yalow),两年后,他们结为夫妻。

第二次世界大战给许多人带来了深重的灾难,而罗莎琳却“因祸得福”。当时美国大多数男青年都参了军,许多学院和研究院因而空出了不少的职位,罗莎琳终于如愿以偿地当上了伊利诺大学工程学院的助教。欣喜若狂的她却万万没有想到,系主任原来是一个极端歧视女性的人。在学院的一次集会上,系主任傲慢地对罗莎琳说:“这只不过是因为现在许多优秀的男青年都应征入伍去了,你才能有机会成为我们中的一员,仅此而已。”这是事实,但在这种场合出于此人之口,无疑是对女性的一种歧视,一种侮辱!罗莎琳的倔强劲儿又一次被激活了,从小就有“巾帼不让须眉”的秉性,这一次她要拿出实际行动来“教训教训”系主任。为此,在紧张的教学之余,她旁听了两门大学部的物理学课程,选修了三门研究生课。到学期末,罗莎琳除了光学的实验课得了“A-”外,其余课程全部是“A”。没想到,骄人的成绩却被系主任抓住了这个唯一的“A-”,来了个“一叶障目”法:“这证明妇女的实验工作能力很差。”直把刚烈的罗莎琳气得火冒三丈。

学院对女性的歧视虽然使罗莎琳产生了极大的心理压力,但她却从没屈服过、退缩过,凭着自己的“倔强劲儿”,她在入校的第二年就取得了硕士学位,3年后,又以优异的成绩和出色的论文获得了博士学位,成为伊利诺大学物理系的第一位女博士。

1945年1月,罗莎琳获得核物理学博士学位,她的导师是著名的高顿哈勃(Goldhaber M)博士, 在他的鼓励和支持下, 罗莎琳开始接触放射性物质及实验设备,这为罗莎琳以后工作奠定了基础。1945年9月,罗莎琳通过丈夫认识了库安碧(Quimby E)博士,使她首次接触到放射性同位素在医学上的应用。1947年12月,罗莎琳在布朗克斯(Bronx)美国退伍军人管理局医院获得了一个半日制工作的职位,在以后的三年时间里, 她和一些内科医师建立了放射性同位素室。1950年1月,罗莎琳辞去了教学工作, 选择了退伍军人管理医院的全日制工作职位。稍后,索罗曼A.贝尔森加入了罗莎琳的研究小组,开始了长达22年的研究伙伴关系,共同建立放射性免疫检测技术。

1952年梅尔斯科.博班(Mirsky.Buban)曾提出了一种假说:成年型糖尿病患者的发病原理不是由于胰岛素分泌的缺乏,而是由于胰岛素的迅速降解之故。为了检验这种假说的正确性,罗莎琳给糖尿病患者和非搪尿病的人静脉注射了用放射性碘同位素标记的猪胰岛素。曾经接受过胰岛素治疗的病人和从未接受过胰岛素治疗的人相比较, 前者血浆中放射性碘同位素标记的猪胰岛素的浓度下降更缓慢。罗莎琳和贝尔森分析了这种现象,认为这是由于外源性的胰岛素刺激机体产生了抗体,而这种抗体又能与注射的猪胰岛素结合。但他们的这种观点与当时经典的免疫学理论不相符。而当时普遍接受的观点是象肽类激素这样小分子量的物质不能刺激机体产生抗体。罗莎琳和贝尔森不为固有的理论所束缚,继续寻找能检测胰岛素抗体的方法。他们将接受过胰岛素治疗的病人血清电泳,发现放射性碘标记的胰岛素结合到与球蛋白之间的位置,因而推测这是胰岛素抗体所在的位置。为了论证自己观点的正确性, 罗莎琳和贝尔森经过两年艰苦的工作,建立了测定血中肽类激素的新方法-放射免疫测定法。

图42.工作中的罗莎琳(https://en.wikipedia.org/wiki/Rosalyn_Sussman_Yalow)

1959年,罗莎琳和贝尔森第一次精确地测定出人体血浆的胰岛素浓度,证实了成年糖尿病人血浆中胰岛素并不缺少,只因与胰岛素抗体结合而丧失了降血糖的效能。此事一经公布立即轰动了美国的医学界。

从1972年至1976年,她先后荣获12项医学研究奖。1977年10月13日上午6点3刻,正当罗莎琳在实验室工作时,电话铃响了,传来了斯德哥尔摩的佳音,她荣获了这年的诺贝尔生理学与医学奖。不幸的是,贝尔森于1972年4月11日逝世, 使他不能和罗莎琳共同分享1977年的生理与医学诺贝尔奖的荣誉。因为世界的所有科学奖,包括诺贝尔奖在内,只奖给活着的的科学家,而不会给死去的科学家,即使这位科学家为世界的科学技术做出再大的贡献,一旦去世,就失去了获奖的资格。

罗莎琳•苏斯曼•雅洛的成功在于自幼就有倔强不屈的精神,“坚持自己的选择,走自己的路。”很多人都曾这样想过,但真正能够做到者却寥无几人。

图43.罗莎琳•苏斯曼•雅洛(RosalynSussmanYalow 1921-2011)(https://en.wikipedia.org/wiki/Rosalyn_Sussman_Yalow)

放射免疫法包括两个方面的技术:第一是生物学方面的,它利用了特殊抗体与抗原的反应,第二是物理学方面的,它将有放射性同位素引入。

放射免疫法,是一种灵敏度高、较简便得测量法,几乎放射免疫法,是种灵敏高、较简便得测量法,几乎可测定生物体内任何物质,包括生物体本身分泌的各种激素,病人口服或注射各种药物,一些病毒抗原等,已广泛用于生物常规检验。

放射免疫分析法的发明是医学界的一场革命。使用这种方法能够准确地检测出血液和尿液中任何低于百万分之一克含量的生物物质,如荷尔蒙、病毒、维生素和药物等,这些物质的浓度差可以给出生命或死亡的信息,能为许多疑难疾病的诊断和治疗提供重要的依据,因而被称为是二战后“在临床医学中具有最重要的基础研究成果。