糖尿病与胰岛素的故事(五)

13.桑格的贡献

弗雷德里克·桑格(Frederick Sanger,1918-2013)出生于英国格洛斯特郡,从布莱恩斯滕高中(Bryanston School)毕业后,进入了剑桥大学圣约翰学院,1939年完成自然科学学士学位。父亲是一名医生,因受父亲的影响,他原本打算研究医学,因在剑桥,受到当时的生物化学先驱们的影响,转而对生物化学感兴趣,1943年获得哲学博士学位,之后留校跟随正在研究胰岛素的生物化学系新任教授阿尔伯特·查尔斯·奇布诺尔开始了博士后研究,专注于氨基酸排序的工作。

桑格因建立了蛋白质的氨基酸序列测定方法,确定了牛胰岛素的氨基酸序列,同时证明蛋白质具有明确构造,获得1958年诺贝尔化学奖;他还建立了快速测定DNA序列的双去氧终止法(桑格法),于1980年再度获得诺贝尔化学奖。在科学史上,桑格成为继玛丽亚·居里、莱纳斯·鲍林、约翰·巴丁之后,第四位两度获颁诺贝尔奖,且是迄今为止唯一两次获得化学奖的科学家。他被认为是20世纪世界最伟大的科学家之一。

桑格和助手塔丕从 1945年开始,就在一间半地下实验室开始了人们不看好的蛋白质氨基酸序列测定的研究,花了10年功夫,在1955年完成了胰岛素完整的氨基酸序列测定。在桑格涉足胰岛素研究之时,世界生物学界对于蛋白质的认知存在较大分歧,一种观点认为,蛋白质没有明确的化学组成和结构;而另一派则坚持认为蛋白质具有结构,并且可以通过化学方法测定氨基酸的排列顺序。桑格选择了分子中只有51个氨基酸的牛胰岛素作为样本,开始了他的研究。

他利用自己发明的桑格试剂,也就是2,4-二硝基氟苯与胰岛素反应,使得2.4-二硝基苯基牢固的结合在胰岛素蛋白链N-端的氨基上,然后用盐酸将胰岛素彻底水解,进行纸层析,根据不同氨基酸在展开剂中的溶解度和分配系数的不同分离成一系列斑点,然后再与层析展开的垂直方向进行电泳,发现有两个黄色氨基酸斑点,与标准氨基酸和2,4-二硝基氟苯反应产物对比,可以确定它们分别是甘氨酸和苯丙氨酸,这证明胰岛素由两条蛋白链组成,每个蛋白链的N-端氨基酸分别是甘氨酸和苯丙氨酸。然后分别对两个蛋白链进行有限水解,形成大小不同的短的片段,与2,4-二硝基氟苯进行反应,然后电泳分离和彻底水解,进行层析-电泳,确定每个小片段的N-末端氨基酸。掌握蛋白链的不同水解条件,将其降解成不同的小片段,再进行N-端氨基酸测定,如此可以确定每个片段的氨基酸排列顺序。之后,根据不同片段和交叉片段的氨基酸排列顺序,推导出完整的胰岛素的氨基酸排列顺序。

桑格的研究证明牛胰岛素由A、B两个肽链组成,A链有21个氨基酸11种,B链有30个氨基酸15种,共26种51个氨基酸组成。其中A链第7位的半胱氨酸与B链第7位的半胱氨酸、A链第20位的半胱氨酸与B链的第19位半胱氨酸的巯基形成两个二硫键,使A、B两链连接起来;此外A链中第6位半胱氨酸与A链第11位半胱氨酸的巯基之间也存在一个二硫键。

图28.牛胰岛素的化学结构

桑格成功地测定了牛胰岛素化学结构,为蛋白质的氨基酸序列测定的发展,及人工合成和改造胰岛素奠定了坚实基础。因此桑格独享了1958年诺贝尔化学奖。

图29.弗雷德里克·桑格(Frederick Sanger,1918-2013)获得1958年诺贝尔化学奖(引自网络)

图30.测定氨基酸序列的层析-电泳图(引自网络文献)

现在看来这项研究就像“1+1=2”那么简单,可在当时,人们只知道蛋白质是由19种常见氨基酸组成,但它们是以何种方式构成蛋白质的却一无所知。要想搞清楚蛋白质中氨基酸的排列顺序,没有那么容易。比如说,一个蛋白质只含有19种不同氨基酸,在序列中每种氨基酸只出现一次,19种氨基酸在一条肽链上可能就有大约有12亿亿种排列方式。

这是一个十分费力的研究工作,而且很多时候根本得不到准确的结果。对于这个并不被世人看好的研究,桑格在那间和别人共用的实验室里,就挨着关着小白鼠的笼子旁边,桑格坚持了10年。桑格还因为使用一种标记氨基酸的化学试剂,影响到共用实验室的其他人,而遭到投诉,不得不停止使用。

事后回忆这项研究,桑格也觉得“非常艰苦”。但桑格还是觉得这是他“工作过的最美妙的地方”。实验室对他来说,始终难以割舍。

随着生物化学与分子生物学的发展及高新技术在生命科学研究的应用,蛋白质序列测定技术发展非常迅速。开始时手工测定,这种方法既费时又浪费样品;1967年研制出蛋白质测序仪,从此开始了使用仪器测定蛋白质序列的新时代,使得蛋白质测序有了迅速发展。不仅减少了测定周期和样品使用量,提高了分析精度和准确性,现在已经成为广泛使用的超微测序技术。现在一个蛋白质样品只需几个到十几个小时,几微克,甚至几纳克就可以完成。

图31.桑格与蛋白质模型(引自网络)

继氨基酸序列测定完成之后,桑格又开始了另一项研究。1975年,桑格发明了一种称为链终止法的测定DNA序列方法,这种方法又称做“双去氧终止法”或是“桑格法”。两年之后,他利用此技术成功地测定了Φ-X174噬菌体的基因组序列,这也是首次完整的基因组测序工作。他发明的方法与其他方法相比,使用的材料毒性较低,而受到欢迎。

桑格的DNA双去氧终止法测序是基于PCR技术,在核酸模板、核酸聚合酶、引物和四种单脱氧碱基存在条件下复制或转录时,如果在四个试管的反应系统中分别按比例加入四种双脱氧碱基,只要双脱氧碱基掺入链端,该链就停止延长,而链端掺入单脱氧碱基的片段可继续延长。如此每管反应体系中便合成以共同引物为5’端,以双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后,分四个泳道进行电泳,以分离仅差一个碱基的长短不一的核酸片段,根据片段3’端的双脱氧碱基,便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。

图32.1980年再次获得诺贝尔化学奖的桑格(引自网络文献)

图33.双脱氧法测序原理示意图(引自《中国科学报》 2013-12-20 第5版人物周刊)

这项研究后来成为人类基因组计划等得以展开的关键之一,并使桑格于1980年与合作研究的沃特·吉尔伯特以及另一团队的保罗·伯格(Paul Berg)再度获得诺贝尔化学奖。1979年,桑格又与吉尔伯特和伯格一同获得哥伦比亚大学的路易莎·格罗斯·霍维茨奖。

1983年的一天,桑格在专心做实验时突然感到自己已经老了,于是停下了实验并宣布自己退休,从此在自己的花园里度过了大部分余生。

桑格及是坚忍不拔的科学研究斗士,又是个淡泊名利名利的人。桑格和其他科学家一样,在科研道路上也并非一帆风顺。面对失败,他也有自己的一番感悟和应对之道:“我想在大多数人的研究道路上,都会经历一些失败的时期。这会让人觉得郁闷,甚至绝望。对此我找到了最好的解决办法,就是继续向前看。当一个实验完全失败时,最好不要花太多时间再去担心它或者懊恼,而应该继续规划和投入下一个实验当中。新的实验总会令人兴奋,这样你很快就会忘却烦恼。”

1986年,桑格获得英国最高荣誉“功绩勋章”,但拒绝封爵,因为他不喜欢别人称自己为“爵士”,桑格就是这样的人。尽管桑格在生物化学领域成就显赫,被认为是蛋白质分子生物学和基因学领域的奠基人,但他并未真的蜚声学术界之外,而这也是桑格为人低调谦逊所致。有报道称,桑格谦虚到几乎有点令人难以理解,他称自己只不过是一个“爱在实验室胡闹”的人。还有同事形容桑格实在太低调了,以至于他被人当作实验室里的清洁工人。所以桑格拒绝接受“爵士”名号也就不以为奇了。

图34.退休后的桑格(广州日报 2014年2月22日)

14.早期临床上使用的胰岛素

1923年麦克劳德和班廷将胰岛素的专利交于多伦多大学,很快美国礼来公司获得生产权,并于当年开始大量生产供应临床应用。同样在欧洲丹麦诺和诺德生物制药公司的胰岛素也很快上市。胰岛素使用至今,虽然不能治愈糖尿病,但却持续不断地挽救着无数人的生命。

时至今日,糖尿病已经成为继肿瘤、心脑血管疾病之后的第三大杀手,被医学界称为“万病之源”,严重威胁着人类的健康。作为糖尿病治疗中不可或缺的重点药物,胰岛素自20世纪60年代开始在我国使用至今,其临床治疗和市场均已逐渐走向成熟。胰岛素是最有效的糖尿病治疗药物之一,胰岛素制剂在全球糖尿病药物中的使用量位居第一。对于Ⅰ型糖尿病患者,胰岛素是唯一治疗药物,此外,约有30-40%的Ⅱ型糖尿病患者最终也需要使用胰岛素。

而最初上市临床使用的胰岛素几乎都是从猪或牛胰脏中提取的。不同动物的胰岛素组成均有所差异,猪胰岛素与人胰岛素的差别很小,只是在B链末端差了一个氨基酸,猪胰岛素是丙氨酸,而人的胰岛素是苏氨酸。牛胰岛素与人胰岛素相差三个氨基酸,除了B链末端,在A链中还相差两个氨基酸。

图35.人、猪、牛胰岛素的差别(引自网络文献)

猪和牛胰岛素虽然价格相对便宜,但是资源有限。就Ⅰ型糖尿病患者来说,每天必须注射胰岛素,如果都从猪的胰腺提取,一个患者一年的药物需要量,大概需要杀掉70头猪,我国Ⅰ型糖尿病患者大约有400-500万,就按450万计算,大约需要杀掉3.15亿头猪。这还没有包括有近30%左右的Ⅱ型糖尿病患者也需要注射胰岛素,现在大约有3千万Ⅱ型糖尿病患者。为生产所需的胰岛素,需要杀掉的猪量也需翻6-7倍,总需求是20.5亿头猪。在我国,虽然人们习惯食用猪肉,我国猪肉年消费量占到世界的50%以上,大约也就是5700多万吨,相当于大约40万头猪,与20.5亿头相比,只是个零头。为了解决糖尿病治疗的猪胰岛素的生产问题,还需要饲养更多更多的猪。而猪肉市场需求有限,销售不了的猪肉成为负担,直接影响养猪业的发展。为了饲养这些猪,需要消耗大量的饲料、粮食,产生大量猪粪便需要处理,这样会带来严重的资源和环境问题。

猪或牛胰岛素都不是人体的蛋白质,长期使用会产生免疫反应,在人体内会产生抗体,与胰岛素结合形成抗体-抗原复合物,造成胰岛素治疗效果下降,少数患者免疫反应较严重,可出现皮疹、发烧,全身发痒,甚至血压下降、休克等问题。

在胰岛素的化学结构上,猪胰岛素比牛胰岛素更接近人胰岛素,在相对的治疗效果和副反应上猪胰岛素也比牛胰岛素好些,所以我国在临床上用于糖尿病治疗的主要是猪胰岛素。但是长期使用就会出现免疫反应、疗效下降的问题。

15.猪胰岛素的改造

为了解决这些问题,上个世纪70年代初,美国加利福尼亚大学的生物化学家卢登堡利用化学方法成功地将猪胰岛素改造成为人胰岛素。这一方法一共有五步,首先用胰蛋白酶将猪胰岛素分子中的B链上最后8个氨基酸脱去,然后在脱去这些氨基酸的部位,再连接上人工合成的相当于人胰岛素B链最后8个氮基酸的化合物,这样就可以得到在分子结构上与人胰岛素一样的胰岛素。这个方法最初因生产成本过高,无法应用,后来经改进,可以在一个反应器中进行生产,成本降低至仅为猪胰岛素的2-3倍,将猪胰岛素改造成为人胰岛素才已获成功。

后来,人们发现在pH为6-7的有机相中使用胰蛋白酶催化,在过量的苏氨酸叔丁酯的存在下,可以将猪胰岛素B链C末端的丙氨酸替换下来,形成的人胰岛素叔丁酯再用三氯乙酸脱去叔丁酯基团,最终获得人胰岛素,该过程的总转化率为60%。这种方法使得猪胰岛素改造成为人胰岛素更加简便,生产成本更加低廉,使得猪胰岛素改造成人胰岛素在临床上治疗糖尿病成为现实。

图36.猪胰岛素改造成为人胰岛素的示意图